复杂制剂应用专题 | 脂质纳米粒制备及表征解决方案

脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle，LNP)是一种粒径介于 10-1000 nm 的新型药物递送载体，由多种有机材料、无机材料、金属 -有机框架或这些材料组合而成,可作为化学与生物制剂之间传递的媒介，脂质纳米粒包裹药物可显著提高药物的稳定性与生物利用度。^[1]  目前脂质纳米粒广泛应用于mRNA疫苗递送、肿瘤治疗、抗炎和抗感染药物载体、治疗神经退行性疾病、抗疟等领域。纳米混悬剂制备流程概述。

脂质脂质纳米粒可分为固体脂质纳米粒(SolidLipid Nanoparticles，SLN)和纳米结构脂质载体(Nanostructured Lipid Carriers，NLC)。固体脂质脂质纳米粒(SLN)主要是由固体脂质、表面活性剂、有效成分和水制备的胶体颗粒，具有生物相容性好、有机溶剂使用少、体内稳定性高、应用范围广等优点。但在储藏过程中仍存在载药量低、易凝胶化和药物泄漏等问题;为此，研发人员尝试在固体脂质壁材中加入一定量的液体油脂，打乱了原来单纯固体脂质壁材的有序的品体结构，负载活性成分的量得到了提高，也使得晶体结构更加稳定，不易发生泄露等现象。^[2][3]

图1 LNP的结构^[3]

脂质纳米粒靶向性研究是药物递送热点研究方向之一，考虑到纳米药物自身性质的影响，可通过对其自身物理化学性质进行调控，如粒径、表面电荷、表面修饰物等，以此来增加脂质纳米粒药物的渗透作用。目前还开发了各种粒径可调控的纳米递药系统，Li等^[4][5]构建了一种酸刺激响应型脂质纳米粒，可以在低pH条件下将其粒径从 100 nm 缩减到5 nm。脂质纳米粒的初始尺寸有利于长时间的血液循环，当到达肿瘤部位后，酸性环境刺激脂质纳米粒发生结构变化，粒径缩小，有助于脂质纳米粒外渗和组织渗透。除pH 响应外，肿瘤组织处特异的酶环境、肿瘤细胞内的还原环境和光、热、磁等外部刺激都可以用于调控纳米药物的粒径和表面电荷。^[5]

除平均粒径外，脂质纳米粒的尾端大颗粒和过小颗粒也会影响纳米药物的效果，尾端大颗粒容易造成脂质纳米粒聚集，影响药物的稳定性和安全性，小颗粒(<5nm)会被直接脏快速地过滤清除，影响药物的有效性，过滤可有效减少脂质纳米粒药物中的大颗粒和杂质，提高脂质纳米粒药物的稳定性。

传统的脂质纳米粒制备技术，包括乙醇注入法、薄膜分散法、逆向蒸发法、冻融法等，存在粒径分布广和批间重复性大等问题，对药物开发的临床试验和生产具有很大的影响。为了解决传统制备方法的弊端，微流控混合技术、高压微射流技术、高压均质等新型制备技术应运而生。

高压微射流制备方法:制备水相、油相，经过混合、剪切步骡形成初乳，初乳经微射流均质机均质，而后除菌过滤得到脂质纳米粒。

微流控混合技术制备方法:制备水相、油相，将水相油相经过微流控均质乳化后，除菌过滤得到脂质纳米粒。

无论是通过何种方法制备脂质纳米粒药物，后续都需要对其平均粒径、尾端大颗粒、稳定性进行检测来筛选配方，PSS的Nicomp粒度分析仪可用于测试平均粒径、Accusizer颗粒计数器可用于测试大颗粒浓度、Lum稳定性分析仪可用于快速筛选在不同工艺制备下脂质纳米粒药物的稳定性。

图2 高压微射流法制备脂质纳米粒

图3 微流控混合技术法制备脂质纳米粒

脂质纳米粒的粒径与其靶向性和有效性紧密相关，粒径小且分布窄是脂质纳米粒药物的理想粒径。微流控技术通过微米通道控制流体的流动和混合，具有良好的单分散性、可控性及重现性，可改善脂质纳米粒的均一性和药物包封效率，并实现高通量生产，已成功应用于covid-19 mRNA 疫苗的制备[6]。高压微射流均质技术使物料在高压作用下以高速度流经腔体，经过剪切、碰撞、空穴效应等物理作用降低脂质纳米粒的平均粒径，可对脂质纳米粒初乳进一步均质分散。

图4 PSI-20 高压微射流均质机

• 最高2069 bar的均质压力，最高处理量20L/h(PSI-20)

• 采用特殊设计y型腔，去除尾端大颗粒效果佳，物料的混合更均一，处理效率高

• 屏显界面，数据可溯源:支持数据导出设定压力及实时压力、监测点温度、实时流量、时间等

• 配置K型热电偶:可用于实施监测料液温度

• 低噪音:运行音量低于70分贝，工作环境友好

脂质纳米粒径不同使药物富集在不同部位可现不同治疗效果。应用于肿瘤治疗领域的脂质纳米粒，由于肿瘤组织处血管丰富，血管壁间隙较宽且结构完整性差，具有适宜尺寸的脂质纳米粒(60-200 nm)可通过 EPR 效应在肿瘤处积聚，实现纳米药物的被动靶向。

脂质纳米粒电性一般呈中性或轻微负电性，在血液循环中，高正电性的脂质纳米粒会吸附蛋白质，被迅速清除,进而影响脂质纳米粒的药代动力学和生物分布。相比之下，中性脂质纳米粒以及带有轻微负电荷的脂质纳米粒则显示出延长的半衰期。Zeta电位是衡量药物稳定性指标之一，Zeta电位的绝对值越高，体系越稳定。

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

图5 微射流均质原理图

• 粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

• 搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

• 高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然现实较好的分辨率和准确度。

图6 高斯粒径分布图

图7  多峰粒径分布图

尾端大颗粒的存在会影响药物本身的稳定性，由于表面积增大，使得体系形成热力学不稳定体系，容易发生脂质纳米粒聚集以降低体系自由能现象。尾端大颗粒的存在还会对身体机能造成影响，较大的颗粒(>200 nm)容易积聚在肝脏和脾脏中，影响药物安全性;粒径极小(<5 nm)的颗粒则会被肾脏快速地过滤清除，影响药物的有效性。

图8 AccuSizer A7000系列

• 检测范围为0.5μm-400μm（可将下限拓展至0.15μm）

• 0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024个数据通道，能反映复杂样品的细微差异，为研发及品控保驾护航

• 灵敏度高达10PPT级别，即使只有微量的颗粒通过传感器，也可以精准检测出来

LumiSpoc采用单粒子光散射技术(SPLS)，通过在光学流通池中进行流体动力聚焦，将单个粒子排列成一条直线。通过调整流动条件来调整样品浓度，从而避免浓度峰值的影响。当单个纳米或者微米颗粒经过特殊光束截面的激光束时，记录其正向和侧向散射的光强。根据米氏理论，将分类强度转换为粒度分布密度。通过软件分析显示计数分布、颗粒浓度。在行业内已有使用Lumispoc用于颗粒浓度的监测成功案例。

图9 LumiSpoc 单粒子颗粒计数器仪器

• 颗粒粒径检测范围: 50nm~8μm(取决于样品)

• 颗粒浓度检测范围:1x 10⁶ml^-1~1 x 10⁹mI^-1

• 进样体积: 250 μL

稳定性是评价药物制剂质量的重要指标之一，也是确定药物制剂使用期限的主要依据。药物制剂若发生分解、变质，可导致药效降低，甚至产生或增加毒副作用，危及患者的身体健康和生命安全，eta电位、尾端大颗粒浓度都是衡量药物稳定性的指标之一。除此之外，还可以使用稳定性分析仪测量样品的分离、沉降、悬浮或澄清、浮离、聚集、凝聚或产品存放期以及粒径分布。

Lum稳定性分析仪可以直接测量整个样品的分散体的稳定性，检测和区分各种不稳定现象，如上浮、絮凝、聚集、聚结、沉降等，通过测量结果可用来开发新的配方和优化现有的配方及工艺。

图10 LUM稳定性分析仪

• 快速、直接测试稳定性，无需稀释，温度范围宽广。

• 可同时测8个样品，测量及辨别不同的不稳定现象及不稳定性指数。

• 加速离心，最高等效2300倍重力加速度。

经高压微射流均质机或微流控技术处理的脂质纳米粒，还需进行适当的过滤工艺，用于去除脂质纳米粒药物中的尾端大颗粒和杂质，提高药物的稳定性和安全性。滤膜的材质和型号将影响脂质纳米粒药物的过滤效率和效果，综合考虑膜与纳米药物配方的兼容性、成本、效率等多方面因素选择合适的滤膜。

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜过滤企业，专业从事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔径为0.03μm~10μm）微孔膜的研发及生产，具有二十多年服务与医药客户经验，并为全球生物制药、医疗器械、食品饮料、实验室分析、微电子及工业等领域的客户提供过滤、分离和净化解决方案。

参考文献

[1 ]曹聪聪,凌耿飞,杨春华.人参皂苷Rg1纳米粒局部注射治疗大鼠心肌梗死[J].中国组织工程研究,2023,27(25):3977-3983.

[2] 唐香,余善君,周向东,李琪.纳米结构脂质载体用于肺靶向递送体系研究进展[J].中国药业,2023,32(02):1-5.

[3] 递送载体|脂质脂质纳米粒(LNP)简介,爱塞生物

[4]  Li HJ, Du J-Z, Du X-J, et al. $timul i-responsive clustered nanoparticles for improved tumor penetration and therapeutic efficacy [u]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America. 2016.113(15):4164-4169.

[5] 许嘉敏.核壳式糖原纳米载体的构建及增强肿瘤渗透和基因递送研究[D].江南大学,2022.D01:10.27169/d.cnki. gwqgu.2022.001880.

[6] 王朝辉,刘玉玲.抗肿瘤纳米药物的临床转化进展及展望[J].药学学报,2022,57(01):134-141+277.D01:10.16438/j.0513-4870.2021-1259.