780SIS测量不溶性微粒结果不平行原因及分析确证

问题：
某客户同一瓶混悬液以1:50的比例复溶到不同的容量瓶中，根据CP-0903章节要求，用780SIS测试10μm和25μm以上的不溶性微粒，检测结果不平行。用同样的方法使用国产颗粒计数器时，重复性较好。客户怀疑是否是因为分辨率过高导致检测结果不平行？
可能原因分析：
1、客户软件测试方法设置中将 tare volume 设为 0，会造成仪器刚运行时的注射器流速不稳定，引起误差，且进样量是 5ml，由于采用的是小容量测样模式，样品为50ml/瓶，5ml 的进样量略少会放大测量误差；
2、客户重现他们样品处理及测量的全过程，有几处可能会引入外来粒子： ① 只测量原瓶的乙酸中的粒子背景，未测量转移到容量瓶后的背景，不能保 证容量瓶的干净程度； ② 加入样品到容量瓶中时样品沉底，需要超声才能溶解，但有样品结块现象 出现，不能保证样品量全部溶解； ③ 超声时样品时不时拿出来上下晃动，未能完全保证超声时间一致； ④ 测样时洁净台未完全合拢，窗户打开，可能会引入粒子。




实验方案验证：

通过排查原因，认为重复性不好的原因就在于样品处理过程繁杂，引入了外来粒 子，故在摸索方法时应最大限度地减少容器的使用，且转移过程要在洁净台上操作，具体 方法如下： 1. 为方便样品溶解，将容器由容量瓶换为烧杯，复溶前需搅拌两分钟（防止粒子 沉降），检测烧杯中的粒子数目，之后扣除。 2. 用干净的胶头滴管移除烧杯中多余的乙酸至 50ml，之后边搅拌边加入 1ml 样 品，由于样品中有大量气泡，移液器需缓慢移取，防止样品量不足。 3. 将烧杯放入超声机中超声 5min，使样品全部溶解，由于烧杯是敞口瓶，超声过 程中注意不要引入外来粒子。 4. 超声后将样品静置两分钟，进样管先抽空（防止混入其他杂质粒子）再插入到 样品底部，进行测量。 5. 方法中设置 tare volume=1ml，进样量为 9ml，取样更加充分。 Attention：从样品前处理到测量完成，除超声操作外全过程均在洁净台上进行，开启洁 净台，防止引入粒子。


由于客户怀疑数据重复性差是仪器通道数太多，分辨率过高的原因，此次我们和客户 一起用上述摸索的方法做了同瓶样品三种不同通道的数据，如下表：
下表中 1号、2号、3号为三个不同的样品，run1、run2、run3为三个样品分别稀释一次后的检测结果。

Channel=64		Background		Measurement
		counts		counts		counts/container
	RUN	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm
1号	1	105	4	255	3	1583	56
	2	67	7	236	3	1511	6
	3	69	1	258	4	1478	0
	Mean	80	4	250	3	1524	21
2号	1	24	0	208	1	1156	6
	2	18	3	235	6	1306	33
	3	15	0	194	4	1078	22
	Mean	19	1	212	4	1180	20
3号	1	18	0	285	10	1417	17
	2	14	1	272	1	1311	17
	3	12	2	266	0	1433	22
	Mean	15	1	274	4	1387	19

 

Channel=128		Background		Measurement
		counts		counts		counts/container
	RUN	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm
1号	1	42	1	233	4	1294	22
	2	42	1	245	2	1361	11
	3	35	0	229	4	1272	22
	Mean	40	1	236	3	1309	18
2号	1	83	1	240	10	1333	56
	2	91	4	237	5	1317	28
	3	83	4	213	3	1183	17
	Mean	86	3	230	6	1278	34
3号	1	35	0	294	0	1633	0
	2	60	3	281	3	1561	17
	3	40	0	280	2	1556	11
	Mean	45	1	285	2	1583	9

 

Channel=512		Background		Measurement
		counts		counts		counts/container
	RUN	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm	≥10μm	≥25μm
1号	1	42	2	373	6	2072	33
	2	44	0	346	10	1922	56
	3	45	0	360	10	2000	56
	Mean	44	1	360	9	1998	48
2号	1	83	1	363	7	2017	39
	2	90	1	369	5	2050	28
	3	98	0	391	4	2172	22
	Mean	90	1	374	5	2080	30
3号	1	67	2	403	4	2239	22
	2	49	0	379	11	2106	61
	3	57	3	346	2	1922	11
	Mean	58	2	376	6	2089	31

参考上述数据，相较于客户之前同瓶样品 10μm 以上粒子数目 1000#、2500#、 5000#的差异，更改方法后重复性明显有了很大的提高： 1. 固定通道数，三瓶样品之间 10μm 以上的粒子数最大相差 300 个，非常平行； 2. 通道数越多，分辨率越高，512 通道下的数据重复性最好。
 
结论：
客户数据重复性不好的原因在于测量过程中引入了外来粒子，而非仪器本身分辨率 过高，修正后的方法能最大限度增大取样量，降低杂质粒子的干扰，是可行的。
 
奥博士Tips：

1. 在测样前，不要将tare volume设置为0，防止进样管内有残留液体；
2. 在样品量较大时，取样量不宜太少；
3. 为防止样品中进入外界杂质粒子，尽量在超净台上进行样品前处理。